Il Western blot è una preziosa tecnica di biologia molecolare che permette l’identificazione e la quantificazione di specifiche proteine in un campione biologico complesso, grazie all’utilizzo di anticorpi.
Si tratta di una metodica ampiamente applicata nelle tesi sperimentali di ambito biochimico e biomolecolare.
Il procedimento si articola in più fasi:
Estrazione delle proteine dal campione biologico, tramite lisi cellulare con detergenti e successiva quantificazione. È fondamentale ottenere una resa proteica sufficiente e preservare l’integrità delle proteine.
Separazione tramite elettroforesi SDS-PAGE, dove le proteine migrano in base al peso molecolare.
La corretta preparazione del gel di poliacrilammide, l’aggiunta del SDS e le condizioni di corsa sono critiche.
Trasferimento delle proteine dal gel alla membrana (solitamente PVDF o nitrocellulosa). Applicando un campo elettrico, le proteine migrano e si fissano alla membrana. Voltaggio e durata vanno ottimizzati.
Blocco della membrana con soluzioni proteiche per saturare i siti aspecifici ed evitare legami non specifici degli anticorpi.
Incubazione con l’anticorpo primario specifico per la proteina target, seguita da lavaggi. L’anticorpo deve essere diluito correttamente.
Incubazione con l’anticorpo secondario coniugato a HRP, diretto contro l’anticorpo primario. Anche qui critiche fasi di lavaggio.
Rilevamento tramite chemiluminescenza del segnale HRP. Si crea un substrato che emette luce dopo degradazione enzimatica.
Acquisizione del segnale mediante CCD e relativa analisi densitometrica.
Padroneggiare scientificamente tutti questi passaggi richiede una complessa preparazione teorico-pratica, non sempre facile da ottenere in ambito prettamente accademico.
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