La Polymerase Chain Reaction (PCR) in tempo reale per le tesi in biologia molecolare: come ottenere risultati validi

La reazione a catena della polimerasi o PCR è una tecnica di biologia molecolare che permette di amplificare in vitro specifiche sequenze di DNA, producendone un grande numero di copie identiche. Si tratta di una metodica estremamente utile e versatile, ampiamente applicata nell’ambito di tesi sperimentali in ambito biologico-molecolare.

La PCR sfrutta l’azione enzimatica della DNA polimerasi termostabile per replicare il filamento stampo di DNA bersaglio, grazie all’utilizzo di primer complementari che definiscono l’inizio e la fine del frammento di interesse. Attraverso ripetuti cicli di denaturazione, appaiamento primer ed estensione a temperatura ottimale, si ottiene una crescita esponenziale dei frammenti target.

La PCR in tempo reale, in particolare, permette di monitorare questo processo di amplificazione man mano che avviene, quantificando il DNA sintetizzato ad ogni ciclo grazie all’impiego di reporter fluorescenti. Ciò rende possibile determinare con precisione la quantità iniziale di DNA bersaglio nel campione.

Questa tecnica risulta dunque ideale per molteplici applicazioni nell’ambito delle tesi di biologia molecolare, come ad esempio:

Quantificazione assoluta o relativa dell’espressione genica, analizzando cDNA ottenuto da trascrizione inversa. Ciò permette di studiare i livelli di trascritti in diversi campioni cellulari o tissutali, in risposta a trattamenti, condizioni patologiche, ecc.
Genotipizzazione di polimorfismi o mutazioni target mediante sonde specifiche, ad esempio per studi di popolazioni o caratterizzazione di modelli cellulari/animali.
Quantificazione di carica virale nei campioni clinici o sperimentali.
Analisi di enrichment di sequenze target a seguito di immunoprecipitazione del DNA.

Tuttavia, per sfruttare appieno il potenziale di questa tecnica è necessario possedere solide competenze di biologia molecolare e specifici accorgimenti tecnici, non sempre facili da acquisire in ambito universitario.

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